Soluciones Buffer

por Víctor Hugo Tomasi

Tal como nos señala Charlotte Avers (1), la vida depende del agua. Las células generalmente contienen de un 60% a 95% de agua. El agua tiene propiedades importantes que la hacen excepcionalmente adecuada como medio para las actividades celulares.

Las moléculas de agua existen como unidades polares, cuyos electrones compartidos están más cerca del núcleo de oxígeno que del hidrógeno. De esta manera, las moléculas de agua son dipolos; es decir, presentan carga neta positiva en el extremo de la molécula que lleva los dos hidrógenos y la carga neta negativa se ubica en el extremo del oxígeno.

El agua disuelve una cantidad considerable de casi cualquier molécula que tenga una carga neta o bien grupos polares, en especial, dipolos. Cualquier parte de una molécula con su nube de electrones distribuida asimétricamente o con un dipolo permanente, tal como -OH, es probable que sea muy soluble en agua debido a las fuerzas de atracción producidas entre ellas. Los enlaces de hidrógeno u otros enlaces no covalentes se forman, generalmente, entre las moléculas de agua de la fase solvente (o disolvente) y las moléculas de soluto (o disuelto) que se añaden al agua. El grado relativo de solubilidad depende de cuántos enlaces agua-agua puedan alterarse, cuando los enlaces agua-soluto los reemplacen.

Generalmente, los enlaces agua-agua son más favorecidos, debido a que el sistema se encuentra en estado de menor energía comparado con los enlaces agua-soluto. Por ello, muchos compuestos tienen solubilidad limitada en agua. Los compuestos que con facilidad forman enlaces con las moléculas de agua son hidrofílicos. Los compuestos hidrofóbicos no pueden formar fácilmente enlaces de hidrógeno con el agua y, por tanto, son poco o nada solubles en ese medio.

Cuando una molécula no polar, como el xilol, se mezcla con el agua hay una rápida separación de las moléculas de agua y de xilol. El agua forma enlaces hidrógeno entre ellas, mientras que las del xilol se unen entre sí por interacciones hidrofóbicas u otras fuerzas más débiles. Las moléculas hidrófobas están separadas con efectividad en el espacio de las moléculas de agua. Cada compuesto existe en su propio espacio y no se mezcla con el otro. Si algún grupo con carga eléctrica, por ejemplo un residuo fosfato, se añade a una molécula hidrófoba, ésta será más fácilmente soluble en agua. El aumento de la solubilidad se debe a una mayor capacidad para la formación de enlaces de hidrógeno y otros enlaces entre el residuo cargado eléctricamente y las moléculas dipolares de agua.

Teniendo en cuenta que las moléculas de agua son dipolares, una o sus dos regiones cargadas pueden unirse, dependiendo de la carga o cargas particulares de las moléculas de soluto. En este sentido, no hay dudas de que el agua es un solvente muy eficaz para los iónes con carga eléctrica o para las moléculas inorgánicas electrocargadas, aún cuando se hallen en estado cristalino.

Escala de pH: El agua puede aumentar la disociación de sustancias tales como ácidos o bases débiles, que ya existen parcialmente disociados o en forma ionizada. Aunque la disociación del agua se expresa de manera convencional como H₂O Û H⁺ + OH^-, el ión H⁺ libre no se encuentra como tal. En realidad, el agua se disocia en H₃O⁺ (ión hidronio) y OH^- (ión oxidrilo). Sin embargo, a los fines prácticos, esto puede ignorarse y los iones H⁺ y OH^- son considerados como producto de disociación del agua. La disociación del agua es un proceso en equilibrio a temperatura constante y puede expresarse como:

Keq = [H⁺ ] [OH^-]

[H₂O]

Keq es la constante de equilibrio. La concentración de las moléculas de agua y sus componentes ionizados se expresan en moles por litro. La concentración molar (M) del agua en estado puro es de 55,5 M (gramos correspondientes a un litro de agua dividido el peso molecular del agua, o sea, 1000/18). Las concentraciones de los iones H⁺ y OH^- en el agua son muy bajas (10^{-7 M a 25ºC). Por tanto, podemos simplificar la constante de equilibrio a 55,5 x Keq =} [H⁺ ] [OH^-]. El término 55,5 x Keq, se denomina producto iónico del agua, o constante K_w.

K_w = [H⁺ ] [OH^-]

K_w es la base para la escala de pH. El término pH (potencial de hidrogeniones) se define como:

pH = - log₁₀ [H⁺ ]

Es conveniente utilizar una escala logarítmica para los valores de pH, debido a las amplias variaciones en la concentración de los iones H⁺. Se usa el logaritmo negativo de base 10, de modo que pueda obtenerse una escala de lecturas positivas. En una solución precisamente neutra a 25ºC, [H⁺ ] = [OH^-] = 1 x 10^{-7 M, y el pH de dicha solución es:}

pH = - log₁₀ [H⁺ ] = - log₁₀ (10^-7) = 7.0

El valor 7.0 de pH para una solución neutra se obtiene del producto iónico del agua a 25ºC y no de un estándar arbitrario. En una solución ácida, el pH es inferior a 7.0, ya que la concentración de los iones H⁺ es alta. Por el contrario, en una solución alcalina el pH es mayor que 7.0 porque la solución tiene una baja concentración de iones H⁺. Las mediciones de concentración de iones H⁺ se hacen utilizando un medidor de pH (potenciómetro de H⁺).

Las actividades celulares son extremadamente sensibles a cambios ligeros del pH interno, principalmente, porque la actividad enzimática se ve afectada por la concentración de los iones H⁺. Una enzima tiene su máximo de actividad a un pH característico llamado pH óptimo y su actividad declina bruscamente tanto por arriba como por debajo de ese valor óptimo. Los efectos notables del pH sobre la unión enzima-sustrato o antígeno-anticuerpo in vivo o in vitro reflejan variaciones eléctricas en la superficie de las moléculas reactantes. Dichas variaciones conducen a un cambio estereoquímico de dichas moléculas y a una actividad reducida o nula cuando los valores son inadecuados.

Las variaciones en fracciones pequeñas de una unidad de pH pueden ser nocivas o aún letales para algunas células o inadecuadas para las reacciones enzimo e inmunohistoquímicas sobre cortes de tejidos empleadas en técnica histológica. Estas fluctuaciones en el pH son moduladas por la potente acción reguladora de donadores de protones (H⁺) (ácidos) y aceptores de H⁺ (bases) que están presentes en los líquidos intra o extracelulares de los organismos vivos. Los sistemas reguladores o buffer tienden a resistir cambios en el pH, adicionando o tomando iones H⁺ u OH^-. El principal sistema buffer del plasma sanguíneo de los vertebrados es el par donador-aceptor ácido carbónico-bicarbonato:

H₂CO₃ - HCO₃^-

El pH del plasma sanguíneo humano es regulado a un valor de 7.4. Puede ocurrir daño irreparable si el pH del plasma cae por debajo de 7.0 o se eleva a más de 7.8. La diferencia entre el pH 7.4 y 7.8 en la sangre refleja un cambio en la concentración de los iones H⁺ de sólo 3 x 10^{-3 M. La pequeña magnitud de este cambio destaca la importancia de los mecanismos buffer de pH como moduladores de acidez y alcalinidad de los líquidos celulares.}

Del mismo modo, durante cualquier reacción enzimo o inmunohistoquímica, las moléculas reactantes se acoplarán si la concentración de iones H⁺ es adecuada. La unión de estas moléculas se produce a través de enlaces no covalentes y fuerzas intermoleculares, las que se verán entorpecidas si la concentración de iones H⁺, por tanto pH, no es el correcto. Ajustar el pH de nuestras soluciones, empleadas para la preparación de antisueros, sustratos, baños de lavado, reactivos fijadores, etc., es imprescindible para obtener resultados confiables.

Las soluciones buffer utilizadas en nuestro laboratorio para la preparación de diferentes reactivos son variadas. En bibliografía se reportan distintas fórmulas de preparación y las correspondientes Tablas de pH, cada una de ellas se debe ajustar al objeto de estudio. A continuación de describirá la Solución Buffer de Fosfatos (PBS) a modo de ejemplo, con el propósito de integrar los siguientes conceptos: soluciones, concentración, pH y estequeometría.

Preparar 200 ml de PBS 0.1 M, pH 7.4. Si leemos detenidamente esta consigna, los datos que aparecen se refieren a que: los 200 ml es el volumen final de la solución que necesitamos para trabajar; PBS, por supuesto, es la sigla que designa que nuestra solución se debe realizar con sales de fosfatos (por ejemplo, fosfato diácido de sodio y fosfato ácido de sodio); 0.1 M hace referencia a la concentración de esas sales por litro de disolvente (agua destilada) y pH a la concentración de iones H⁺. Este pH, si bien se lo puede calcular matemáticamente, contamos con la ventaja que ya se encuentra tabulado en bibliografía y, para ello, debemos mezclar las soluciones madres de las dos sales citadas con anterioridad. Si observamos las siguientes fórmulas podemos constatar que estas sales de fosfatos están compuestas por varios átomos:

1) NaH₂PO₄ . H2O PM 137,99

2) Na₂HPO₄ PM 29,39

Si ubicamos esos átomos en la Tabla Periódica conoceremos los pesos atómicos de cada uno, luego sumamos esos pesos atómicos relativos para cada sal y obtendremos los pesos moleculares (PM) de cada una.

Por otro lado, M es la letra que, en Soluciones Químicas, significa concentración Molar y representa la fuerza iónica del buffer. Se entiende por Molaridad al “número de moles que hay en 1000 ml de solución”. En química se dice que 1 mol de cualquier sustancia es igual al peso molecular (PM). Nuestro buffer de trabajo lo debemos preparar con una concentración de 0,1, por tanto y de acuerdo a las formulaciones de García del Moral (2), necesitamos pesar 27,59 gr y 29,39 gr de cada sal, respectivamente. Luego, por separado, disolvemos las sales con agua destilada en matraces aforados hasta 1000 ml. En el momento de usar mezclamos 19 ml de solución de fosfato diácido de sodio, 81 ml de solución de fosfato ácido de sodio y agregamos 100 ml de agua destilada. De esta manera, tenemos 200 ml de PBS 0.1 M, cuyo pH es 7,4.

Ahora bien, si leemos nuevamente esta preparación, determinaremos que tras mezclar las dos soluciones salinas volvemos a agregar 100 ml de agua destilada. Aquí nos preguntamos si este agregado de agua influye en la concentración final del PBS. La respuesta a este interrogante es sí, influye. Lo que sucede es que: 1. la concentración del PBS solicitado debe ser 0.1 M y 2. la cantidad de drogas pesada de cada sal (27,59 gr y 29,39 gr) y disueltas en 1000 ml de agua, corresponden a una concentración final de 0.2 M.

Es por ello que, tras mezclar las dos soluciones salinas 0.2 M, obtenemos un volumen de 100 ml y para bajar al doble la concentración de buffer, o sea a 0.1 M, necesitamos aumentar al doble el volumen final (200 ml) de toda la mezcla con agua destilada.

Con este ejemplo de buffer hemos trabajado soluciones molares que son las más comunes. Sin embargo, existen otras formas de expresar la concentración de una solución.

Se usan soluciones de concentraciones porcentuales: %P/V, %P/P y %V/V, la más empleada es %P/V. Todas se refieren a la cantidad de soluto, sean drogas sólidas o líquidas, disuelta en 100 partes de disolvente. Por otro lado, están las concentraciones químicas: Normales (N), Molales (m) y Molares (M). Todas pueden emplearse, pero las utilizadas rutinariamente son la N y M.

Por “N” se entiende a la cantidad de equivalentes químicos que hay en 1000 ml de solución y por “m” se define a la cantidad de moles que hay en 1000 gr de disolvente.

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VHT

(1). Avers, Charlotte J., (1991). Biología Celular, Capítulo 2, Las Moléculas Orgánicas. 2da. Edición, Grupo Editorial Iberoamericana.

(2). Raimundo García del Moral. (1993). Laboratorio de Anatomía Patológica. Apéndices A y B. Editorial Interamericana, Mc Graw-Hill.