12/09/2008

Reactivos Químicos para Técnica Histológica



La técnica histológica es una metodología empleada en laboratorios de histología animal y vegetal, que permite realizar un preparado histológico para su observación microscópica y diagnóstico. El componente teórico del presente trabajo se encuentra integrado con otros conceptos fundamentales de referencia tomados, en particular, de Wikipedia a fin de profundizar la temática.



por Víctor Hugo Tomasi



Reactivos usados en Técnica Histológica.


Los reactivos químicos son sustancias que imprimen determinadas cualidades en la muestra biológica en estudio, las cuales favorecen su procesamiento sin modificar las estructuras histológicas que la componen. Los reactivos se agrupan de acuerdo a la función química que ejercen sobre el tejido y depende del grupo funcional que se enlaza a la molécula.

Este grupo funcional está representado por un átomo o conjunto de átomos que confiere al reactivo químico propiedades especiales inherentes a su presencia. Por ejemplo, el alcohol etílico, función química, es empleado para extraer las moléculas de agua existentes en la intimidad del tejido. Este proceso de deshidratación se produce debido a la presencia del grupo funcional “hidroxilo”:





El alcohol etílico es, por tanto, un agente deshidratante de la muestra en estudio que elimina el agua a través de su grupo funcional vía puentes hidrógeno. Tal procedimiento permite la posterior inclusión de la muestra en parafina (medio de inclusión hidrofóbico).



Por otra parte, el alcohol etílico también se puede emplear como reactivo fijador tras obtener la muestra, ya que la extracción de las moléculas de agua a partir del tejido provoca la coagulación de proteínas estructurales y solubles, deteniendo los procesos posmortem del tejido. De esta manera, debemos entender que alcohol etílico es un reactivo químico que se puede utilizar para deshidratar o fijar un espécimen. En otras palabras es común emplear, en técnica de rutina, una serie preparada con alcohol etílico en graduación creciente para deshidratar la muestra biológica, la que será incluida en parafina. Este alcohol es utilizado, además, al 95% para fijar extendidos celulares.

Analicemos otro ejemplo, el ácido pícrico se obtiene por acción del ácido nítrico sobre el fenol, tras lo cual quedan incorporados tres grupos nitro (I). De acuerdo a Dehn & Ball (1917), el ácido pícrico en solución también presenta una forma tautomérica (II) y ambas son reactivas con el tejido.

Los grupos funcionales señalados (hidroxilo, nitro, quininoide y carbonilo) hacen que el ácido pícrico se lo pueda utilizar en técnica histológica en diferentes procedimientos:

1. Extrae Ca++ a partir de tejidos calcificados (origina Picrato de calcio).

2. Fija muestras biológicas por inhibición de los procesos autolíticos (Mezcla de Bouin).

3. Colorea diversas proteínas citoplasmáticas (Tinción de Van Gieson).


De esta manera, el ácido pícrico se puede emplear como reactivo descalcificante, fijador o colorante y ello depende del objeto de estudio.


Clasificación

Fijadores: tienen la propiedad de detener las funciones vitales de células y tejidos, inhibiendo además, los fenómenos autolíticos de necrosis, los cuales llevan a la distorsión de la arquitectura del tejido. Estas sustancias no pueden actuar como fijadores si son capaces de atacar las uniones peptídicas. Lejos de ser proteolíticos, los fijadores tienden a unir las cadenas proteicas próximas y, de esta manera, dar estabilidad mecánica. Ejemplos: formol, metanol, cloruro de mercurio, etc.


Aclarantes: son agentes que confieren un elevado índice de refracción al tejido (nD = 1.53), de manera tal, que sería dificultoso distinguir una estructura histológica de otra si éstas no son coloreadas previamente. Ejemplos: xileno, tolueno, benceno, alcohol bencílico, acetato de butilo, glicerina, etc. El xileno, benceno y tolueno se conocen también como reactivos Intermediarios, ya que se emplean entre la deshidratación de la muestra y su impregnación con parafina.

Opacantes: presentan bajo índice de refracción y se emplean para hacer más perceptibles diferentes estructuras histológicas cuando se las observan con microscopía de fase. Ejemplos: soluciones de Tyrode y Ringer.

Descalcificantes: son agentes que extraen el calcio del tejido por mecanismos de precipitación y quelación. Esto provoca el ablandamiento de la muestra, lo cual favorece el corte ulterior con micrótomo. Ejemplos: los ácidos nítrico, tricloroacético, pícrico, fórmico o acético. El etilendiaminotetracético di sódico y el citrato de sodio son quelantes.

Diferenciantes: se utilizan para aumentar la selectividad de la coloración o para eliminar tinciones de fondo inespecíficas, después que los cortes histológicos han sido coloreados. Ejemplos: ácido acético, agua sulfurosa, la mezcla etanol/clorhídrico, los ácidos fosfotúngstico y fosfomolíbdico.

Conservadores: se usan para mantener en condiciones óptimas todo material biológico que se desea guardar durante tiempos prolongados (archivo y piezas anatómicas de museo). Ejemplo: formol, las sales de potasio, glicerina, los medios de montaje, aceite de cedro, etc.

Colorantes: son sustancias que imprimen distintos matices de color al tejido, los cuales permiten identificar las diferentes estructuras histológicas cuando se las observan al microscopio. Ejemplos: Orange G, Verde de metilo, Eosina, Azul de metileno, Fucsina ácida, Galocianina, etc.

Aislantes: estos compuestos se utilizan cuando se desean separar tejidos, células o sus diferentes componentes al disolver las estructuras que los mantienen unidos. Ejemplos: hidróxido de potasio al 5%, tripsina, colagenasa, proteinasa K, etc.

Deshidratantes: son agentes que se utilizan para eliminar el agua del tejido. Ejemplos: etanol, metanol, butanol, acetato de butilo y acetona.

Indiferentes: son sustancias químicas que actúan como vehículo del reactivo principal o que permiten adecuar el medio a las condiciones fisiológicas. Ejemplos: cloruro de sodio, sulfato de potasio, cloruro de calcio, soluciones buffer (ver más abajo).

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